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16S/ddPCR/qPCR联合测序
项目介绍
近年来,菌落16S高通量测序技术为我们提供了群落的菌群结构、进化关系以及群落多样性研究的有效手段,极大地拓宽了我们对微生物群落结构及功能的认识。但目前高通量测序分析结果往往只有微生物分类及其相对丰度,只表征了一个样本中微生物类群的相对比例,不能确定不同分类水平微生物的绝对含量,当样本间总微生物绝对含量存在差异时,可能会得出错误甚至相反的结论。有些学者利用通量量测序结合流式细胞仪、菌落磷脂脂肪酸含量等方法同时对群落微生物进行相对丰度与绝对定量,每种方法都有其局限性,如很多实验室不具备流式细胞仪实验条件,菌落中不同菌的磷脂脂肪酸含量有较大差异,Yang L(Science of the Total Environment 633, 2018)开发一种高通量绝对定量检测方法(HAAQ),HAAQ方法最大的特点就是在样品加入环境样品没有的带GFP标签大肠杆菌作为内置菌,加入前在荧光显微镜下计数定量,再混入样品中参与从DNA提取、PCR、高通量测序整个过程,消除了实验过程中的操作误差,通过高通量的测序结果的相对丰度比例可以推算出各种菌落微生物的绝对定量;Lou J(PeerJ 6, 2018)提出了iHAAQ(Integrated High-Throughput Absolute Abundance Quantification)方法,利用与高通量测序相同的引物对DNA样品进行qPCR绝对定量,从而获得样品的细菌绝对总量,再与高通量测序所得的相对丰度相乘即可获得不同分类水平细菌的绝对含量。
技术支持
电   话 :021-57072083
021-57072062
021-57072064
E-mail :   16s@sangon.com
18s@sangon.com
its@sangon.com
参考该两种方法,我们公司相应的开发了两种方法:一是针对土壤样品开发了一种添加环境中没有的内标菌株进行高通量测序检测相对丰度,并结合数字PCR进行精确绝对定量的检测。我们运用氯霉素抗性替换敲除ahpF基因的DH5α改造菌株,细菌的基因为单拷贝基因组,一个拷贝基因就代表一个菌株,利用数字PCR无需外参照及标曲的优点,检测该单拷贝基因的绝对拷贝数,根据相对丰度推算出各种菌行绝对数量;二是针对样品复杂,无法确定样品中是否可以添加内标菌,我们选用iHAAQ方法,样品无需添加内标菌,直接对样品进行总菌的16S基因进行绝对定量QPCR检测。通过HAAQ和iHAAQ方法为广大科研工作者获取的生态微生物分类、相对丰度和绝对含量等更精准的信息供了新的可靠方法。
  1. 样本要求(参考下方内容)
实验流程图
HAAQ法
iHAAQ法
客户提供
提供样本
样本量:
土壤:1~2 g;粪便:1~2 g;污泥/沉积物:1~2 g;DNA:总量 ≥ 1 μg、浓度 ≥ 20 ng/μL、1.8 < OD260/280 < 2.0
运输:
DNA样品普通冰袋运输,其他样品要求干冰运输(防止菌落结构的变化)。
提供信息
相关样品信息
最终交付
交付报告
  1. 详细的实验过程(含DNA提取,引物探针设计、高通量测序、ddPCR、绝对qPCR定量等内容)
  2. 结题报告